PCR reaksiyonlarında girişim faktörleri

PCR reaksiyonu sırasında sıklıkla bazı müdahale edici faktörlerle karşılaşılır.
PCR'nin duyarlılığının çok yüksek olması nedeniyle kontaminasyon, PCR sonuçlarını etkileyen en önemli faktörlerden biri olarak kabul edilir ve hatalı pozitif sonuçlar üretebilir.
Yanlış negatif sonuçlara yol açan çeşitli kaynaklar da aynı derecede kritiktir. PCR karışımının bir veya daha fazla önemli kısmı veya amplifikasyon reaksiyonunun kendisi inhibe edilirse veya müdahale edilirse tanı testi engellenebilir. Bu, verimliliğin azalmasına ve hatta yanlış negatif sonuçlara yol açabilir.
İnhibisyona ek olarak, numune hazırlama öncesindeki nakliye ve/veya saklama koşullarına bağlı olarak hedef nükleik asit bütünlüğünün kaybı meydana gelebilir. Özellikle yüksek sıcaklıklar veya yetersiz depolama, hücrelerin ve nükleik asitlerin zarar görmesine neden olabilir. Hücre ve doku fiksasyonu ve parafine gömülmesi, DNA parçalanmasının ve kalıcı bir problemin iyi bilinen nedenleridir (bkz. Şekil 1 ve 2). Bu durumlarda en uygun izolasyon ve saflaştırma bile yardımcı olmayacaktır.

Şekil 1 | İmmobilizasyonun DNA bütünlüğü üzerindeki etkisi
Agaroz jel elektroforezi, otopsilerin parafin kesitlerinden izole edilen DNA kalitesinin önemli ölçüde değiştiğini gösterdi. Fiksasyon yöntemine bağlı olarak ekstraktlarda farklı ortalama fragman uzunluklarına sahip DNA mevcuttu. DNA yalnızca doğal dondurulmuş numunelerde ve tamponlu nötr formalinde sabitlendiğinde korundu. Güçlü asidik bir Bouin fiksatifinin veya tamponsuz, formik asit içeren formalinin kullanılması, önemli bir DNA kaybına neden oldu. Geriye kalan kısım oldukça parçalıdır.
Sol tarafta parçaların uzunluğu kilobaz çifti (kbp) cinsinden ifade edilir.

Şekil 2 | Nükleik asit hedeflerinin bütünlüğünün kaybı
(a) Her iki şeritteki 3′-5′ boşluk, hedef DNA'da bir kırılmaya neden olacaktır. Küçük parça üzerinde DNA sentezi yine de meydana gelecektir. Ancak DNA fragmanında primer bağlanma bölgesi eksikse yalnızca doğrusal amplifikasyon meydana gelir. En uygun durumda, parçalar birbirini yeniden doyurabilir ancak verimler küçük olacak ve tespit seviyelerinin altında olacaktır.
(b) Temel olarak depurinasyon ve timidin dimer oluşumu nedeniyle baz kaybı, H bağlarının sayısında bir azalmaya ve Tm'de bir azalmaya yol açar. Uzatılmış ısınma aşaması sırasında, primerler matris DNA'sından eriyecek ve daha az sıkı koşullar altında bile tavlanmayacaktır.
(c) Bitişik timin bazları bir TT dimer oluşturur.
Moleküler teşhislerde sıklıkla ortaya çıkan diğer bir yaygın sorun, fenol-kloroform ekstraksiyonuyla karşılaştırıldığında hedef nükleik asitlerin optimalden daha az salınmasıdır. Aşırı durumlarda bu, yanlış negatiflerle ilişkilendirilebilir. Hücre kalıntılarının kaynatılması veya enzimatik sindirimi yoluyla çok zaman kazanılabilir, ancak bu yöntem genellikle yetersiz nükleik asit salınımı nedeniyle düşük PCR duyarlılığıyla sonuçlanır.

Amplifikasyon sırasında polimeraz aktivitesinin inhibisyonu

Genel olarak inhibisyon, optimal olmayan PCR sonuçlarına yol açan tüm faktörleri tanımlamak için kapsayıcı bir kavram olarak kullanılır. Kesin olarak biyokimyasal anlamda inhibisyon, enzimin aktivitesiyle sınırlıdır, yani DNA polimerazın aktif bölgesi veya kofaktörü (örneğin, Taq DNA polimerazı için Mg2+) ile etkileşim yoluyla substrat-ürün dönüşümünü azaltır veya önler.
Numunedeki bileşenler veya reaktifler içeren çeşitli tamponlar ve ekstraktlar, enzimi doğrudan inhibe edebilir veya kofaktörlerini (örn. EDTA) yakalayabilir, böylece polimerazı etkisiz hale getirebilir ve sonuç olarak azalmış veya yanlış negatif PCR sonuçlarına yol açabilir.
Ancak reaksiyon bileşenleri ile hedef içeren nükleik asitler arasındaki birçok etkileşim aynı zamanda 'PCR inhibitörleri' olarak da adlandırılır. Hücrenin bütünlüğü izolasyon nedeniyle bozulduğunda ve nükleik asit salındığında, numune ile onu çevreleyen çözelti ve katı faz arasında etkileşimler meydana gelebilir. Örneğin, 'çöpçüler' tek veya çift sarmallı DNA'yı kovalent olmayan etkileşimler yoluyla bağlayabilir ve sonunda PCR reaksiyon kabına ulaşan hedeflerin sayısını azaltarak izolasyon ve saflaştırmaya müdahale edebilir.
Genel olarak PCR inhibitörleri, klinik teşhis testleri için kullanılan çoğu vücut sıvısında ve reaktifte (idrarda üre, kanda hemoglobin ve heparin), diyet takviyelerinde (organik bileşenler, glikojen, yağ, Ca2+ iyonları) ve çevredeki bileşenlerde (fenoller) bulunur. , ağır metaller)

Daha yaygın PCR inhibitörleri bakterilerde ve ökaryotik hücrelerde, hedef olmayan DNA'da, doku matrislerinin DNA bağlayıcı makromoleküllerinde ve eldiven ve plastik gibi laboratuvar ekipmanlarında bulunabilir. Ekstraksiyon sırasında veya sonrasında nükleik asitlerin saflaştırılması, PCR inhibitörlerinin uzaklaştırılması için tercih edilen yöntemdir.
Bugün, çeşitli otomatik ekstraksiyon ekipmanları birçok manuel protokolün yerini alabilir, ancak hedeflerin %100 geri kazanılması ve/veya saflaştırılması hiçbir zaman gerçekleştirilememiştir. Potansiyel inhibitörler saflaştırılmış nükleik asitlerde hala mevcut olabilir veya halihazırda etkili olmuş olabilir. İnhibitörlerin etkisini azaltmak için farklı stratejiler mevcuttur. Uygun polimerazın seçimi inhibitör aktivitesi üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir. PCR inhibisyonunu azaltmaya yönelik kanıtlanmış diğer yöntemler, polimeraz konsantrasyonunun arttırılması veya BSA gibi katkı maddelerinin uygulanmasıdır.
PCR reaksiyonlarının inhibisyonu, dahili proses kalite kontrolü (IPC) kullanılarak gösterilebilir.
Etanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, izopropanol ve fenol gibi ekstraksiyon kitindeki tüm reaktiflerin ve diğer çözeltilerin kapsamlı bir yıkama adımıyla nükleik asit izolatından çıkarılmasına dikkat edilmelidir. Konsantrasyonlarına bağlı olarak PCR'yi aktive edebilir veya inhibe edebilirler.