PCR reaksiyonlarında parazit faktörleri

PCR reaksiyonu sırasında, bazı müdahale faktörlerine sıklıkla karşılaşılır.
PCR'nin çok yüksek duyarlılığı nedeniyle, kontaminasyon PCR sonuçlarını etkileyen en önemli faktörlerden biri olarak kabul edilir ve yanlış pozitif sonuçlar üretebilir.
Aynı derecede kritik olan, yanlış negatif sonuçlara yol açan çeşitli kaynaklardır. PCR karışımının bir veya daha fazla önemli kısmı veya amplifikasyon reaksiyonunun kendisi inhibe edilirse veya müdahale edilirse, tanısal tahlil engellenebilir. Bu, verimliliğin azalmasına ve hatta yanlış negatif sonuçlara yol açabilir.
İnhibisyona ek olarak, numune hazırlanmasından önce nakliye ve/veya depolama koşulları nedeniyle hedef nükleik asit bütünlüğünün kaybı meydana gelebilir. Özellikle, yüksek sıcaklıklar veya yetersiz depolama, hücrelerin ve nükleik asitlerin hasarına yol açabilir. Hücre ve doku fiksasyonu ve parafin gömme, DNA fragmantasyonunun iyi bilinen nedenleri ve kalıcı bir problemdir (bkz. Şekil 1 ve 2). Bu durumlarda, optimal izolasyon ve saflaştırma bile yardımcı olmayacaktır.

Şekil 1 | İmmobilizasyonun DNA bütünlüğü üzerindeki etkisi
Agaroz jel elektroforezi, otopsilerin parafin bölümlerinden izole edilen DNA kalitesinin önemli ölçüde değiştiğini gösterdi. Fiksasyon yöntemine bağlı olarak ekstraktlarda farklı ortalama fragman uzunluklarına sahip DNA mevcuttu. DNA sadece doğal dondurulmuş numunelerde ve tamponlu nötr formalinde sabitlendiğinde korunmuştur. Güçlü asidik bir bouin fiksatif veya kaplanmamış, formik asit içeren formalin kullanımı, önemli bir DNA kaybına neden oldu. Kalan fraksiyon oldukça parçalanmıştır.
Solda, parçaların uzunluğu kilobaz çiftleri (KBP) olarak ifade edilir.

Şekil 2 | Nükleik asit hedeflerinin bütünlüğü kaybı
(A) Her iki iplikte de 3′-5 ′ boşluk, hedef DNA'da bir kırılmaya neden olacaktır. DNA sentezi hala küçük fragmanda meydana gelecektir. Bununla birlikte, DNA fragmanında bir astar tavlama yeri eksikse, sadece doğrusal amplifikasyon meydana gelir. En uygun durumda, fragmanlar birbirini yeniden dağıtır, ancak verim küçük ve algılama seviyelerinin altında olacaktır.
(b) esas olarak deprinasyon ve timidin dimer oluşumu nedeniyle baz kaybı, H-bağlarının sayısında bir azalmaya ve TM'de bir azalmaya yol açar. Uzatılmış ısınma aşaması sırasında, primerler matris DNA'sından uzaklaşacak ve daha az katı koşullar altında bile tavlamayacak.
(c) Bitişik timin bazları bir TT dimer oluşturur.
Moleküler teşhislerde sıklıkla meydana gelen bir başka yaygın sorun, fenol-kloroform ekstraksiyonuna kıyasla hedef nükleik asitlerin optimalden daha az salınmasıdır. Aşırı durumlarda, bu yanlış negatiflerle ilişkili olabilir. Hücre enkazının liziz veya enzimatik sindirimi ile çok fazla zaman kaydedilebilir, ancak bu yöntem genellikle yetersiz nükleik asit salınımından kaynaklanan düşük PCR duyarlılığına neden olur.

Amplifikasyon sırasında polimeraz aktivitesinin inhibisyonu

Genel olarak, inhibisyon, suboptimal PCR sonuçlarına yol açan tüm faktörleri tanımlamak için bir konteyner kavramı olarak kullanılır. Kesinlikle biyokimyasal bir anlamda, inhibisyon enzimin aktivitesi ile sınırlıdır, yani DNA polimeraz veya kofaktörün aktif bölgesi (örn. Taq DNA polimeraz için Mg2+) ile etkileşim yoluyla substrat ürün dönüşümünü azaltır veya önler.
Numunedeki bileşenler veya reaktifleri içeren çeşitli tamponlar ve ekstraktlar, enzimi doğrudan inhibe edebilir veya kofaktörlerini (örn. EDTA) tuzaklayabilir, böylece polimerazın inaktive edilmesi ve buna bağlı olarak azalmış veya yanlış negatif PCR sonuçlarına yol açabilir.
Bununla birlikte, reaksiyon bileşenleri ve hedef içeren nükleik asitler arasındaki birçok etkileşim de 'PCR inhibitörleri' olarak belirlenir. Hücrenin bütünlüğü izolasyon ile bozulduktan ve nükleik asit salındığında, numune ile çevresi çözeltisi ile katı faz arasındaki etkileşimler meydana gelebilir. Örneğin, 'temizleyiciler', kovalent olmayan etkileşimler yoluyla tek veya çift sarmallı DNA'yı bağlayabilir ve sonunda PCR reaksiyon kabına ulaşan hedef sayısını azaltarak izolasyon ve saflaştırmaya müdahale edebilir.
Genel olarak, PCR inhibitörleri, klinik tanısal testler (idrar, hemoglobin ve kandaki üre), diyet takviyeleri (organik bileşenler, glikojen, yağ, Ca2+ iyonları) ve ortamdaki bileşenler (fenoller, ağır metaller) için kullanılan çoğu vücut sıvısında ve reaktiflerde bulunur (fenoller, ağır metaller)

Daha yaygın PCR inhibitörleri bakteriler ve ökaryotik hücreler, hedef olmayan DNA, doku matrislerinin DNA bağlayıcı makromoleküllerinde ve eldiven ve plastik gibi laboratuvar ekipmanlarında bulunabilir. Ekstraksiyon sırasında veya sonrasında nükleik asitlerin saflaştırılması, PCR inhibitörlerinin giderilmesi için tercih edilen yöntemdir.
Günümüzde, çeşitli otomatik ekstraksiyon ekipmanı birçok manuel protokolün yerini alabilir, ancak% 100 iyileşme ve/veya hedeflerin saflaştırılması hiç bu kadar elde edilmemiştir. Potansiyel inhibitörler hala saflaştırılmış nükleik asitlerde mevcut olabilir veya zaten yürürlüğe girmiş olabilir. İnhibitörlerin etkisini azaltmak için farklı stratejiler vardır. Uygun polimeraz seçimi inhibitör aktivitesi üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir. PCR inhibisyonunu azaltmak için kanıtlanmış diğer yöntemler, polimeraz konsantrasyonunu arttırır veya BSA gibi katkı maddeleri uygulanır.
PCR reaksiyonlarının inhibisyonu, iç proses kalite kontrolü (IPC) kullanılarak gösterilebilir.
Ekstraksiyon kitindeki etanol, EDTA, CETAB, LICL, GUSCN, SDS, izopropanol ve fenol gibi tüm reaktifleri ve diğer çözeltileri, nükleik asit izolatından kapsamlı bir yıkama aşamasından çıkarmaya özen gösterilmelidir. Konsantrasyonlarına bağlı olarak PCR'yi aktive edebilir veya inhibe edebilirler.