PCR reaksiyonlarında girişim faktörleri

PCR reaksiyonu sırasında bazı engelleyici faktörlerle sıklıkla karşılaşılmaktadır.
PCR'ın duyarlılığının çok yüksek olması nedeniyle kontaminasyon, PCR sonuçlarını etkileyen en önemli faktörlerden biri olarak kabul edilmekte ve yanlış pozitif sonuçlara yol açabilmektedir.
Yanlış negatif sonuçlara yol açan çeşitli kaynaklar da aynı derecede kritiktir. PCR karışımının bir veya daha fazla temel parçası veya amplifikasyon reaksiyonunun kendisi engellenirse veya müdahale edilirse, tanı testi engellenebilir. Bu, verimliliğin azalmasına ve hatta yanlış negatif sonuçlara yol açabilir.
İnhibisyona ek olarak, numune hazırlamadan önceki nakliye ve/veya depolama koşulları nedeniyle hedef nükleik asit bütünlüğünün kaybı meydana gelebilir. Özellikle yüksek sıcaklıklar veya yetersiz depolama, hücrelerin ve nükleik asitlerin hasar görmesine yol açabilir. Hücre ve doku fiksasyonu ve parafine gömülme, DNA parçalanmasının iyi bilinen nedenleridir ve kalıcı bir sorundur (bkz. Şekil 1 ve 2). Bu durumlarda, optimum izolasyon ve saflaştırma bile yardımcı olmayacaktır.

Şekil 1 | Hareketsizleştirmenin DNA bütünlüğüne etkisi
Agaroz jel elektroforezi, otopsi parafin kesitlerinden izole edilen DNA kalitesinin önemli ölçüde değiştiğini gösterdi. Ekstraktlarda, fiksasyon yöntemine bağlı olarak farklı ortalama parça uzunluklarında DNA mevcuttu. DNA yalnızca doğal dondurulmuş örneklerde ve tamponlu nötr formalinde fiksasyon yapıldığında korundu. Güçlü asidik Bouin fiksatifinin veya tamponlanmamış, formik asit içeren formalinin kullanımı önemli miktarda DNA kaybına neden oldu. Geriye kalan kısım oldukça parçalanmıştır.
Solda, parçaların uzunluğu kilobaz çiftleri (kbp) olarak ifade edilir

Şekil 2 | Nükleik asit hedeflerinin bütünlüğünün kaybı
(a) Her iki iplikte 3′-5′ boşluk hedef DNA'da bir kopmaya neden olur. DNA sentezi yine de küçük parçada gerçekleşir. Ancak, DNA parçasında bir primer tavlama yeri eksikse, yalnızca doğrusal amplifikasyon gerçekleşir. En uygun durumda, parçalar birbirini yeniden doyurabilir, ancak verimler küçük ve tespit seviyelerinin altında olacaktır.
(b) Esas olarak depurinasyon ve timidin dimer oluşumu nedeniyle baz kaybı, H-bağlarının sayısında ve Tm'de azalmaya yol açar. Uzamış ısınma fazı sırasında, primerler matris DNA'sından eriyecek ve daha az sıkı koşullar altında bile tavlanmayacaktır.
(c) Bitişik timin bazları bir TT dimeri oluşturur.
Moleküler tanılamada sıklıkla karşılaşılan bir diğer yaygın sorun, fenol-kloroform ekstraksiyonuna kıyasla hedef nükleik asitlerin optimumdan daha az salınmasıdır. Aşırı durumlarda, bu yanlış negatiflerle ilişkilendirilebilir. Kaynatma lizisi veya hücre artıklarının enzimatik sindirimi ile çok zaman kazanılabilir, ancak bu yöntem genellikle yetersiz nükleik asit salımı nedeniyle düşük PCR duyarlılığıyla sonuçlanır.

Amplifikasyon sırasında polimeraz aktivitesinin inhibisyonu

Genel olarak, inhibisyon, suboptimal PCR sonuçlarına yol açan tüm faktörleri tanımlamak için bir kap kavramı olarak kullanılır. Kesinlikle biyokimyasal bir anlamda, inhibisyon enzimin aktivitesiyle sınırlıdır, yani DNA polimerazının veya kofaktörünün (örneğin, Taq DNA polimerazı için Mg2+) aktif bölgesiyle etkileşim yoluyla substrat-ürün dönüşümünü azaltır veya engeller.
Numunedeki bileşenler veya reaktif içeren çeşitli tamponlar ve ekstraktlar, enzimi doğrudan inhibe edebilir veya kofaktörlerini (örneğin EDTA) hapsederek polimerazı inaktive edebilir ve buna bağlı olarak PCR sonuçlarının azalmasına veya yanlış negatif olmasına yol açabilir.
Ancak, reaksiyon bileşenleri ile hedef içeren nükleik asitler arasındaki birçok etkileşim de 'PCR inhibitörleri' olarak adlandırılır. Hücrenin bütünlüğü izolasyonla bozulduğunda ve nükleik asit serbest bırakıldığında, numune ile çevresindeki çözelti ve katı faz arasında etkileşimler meydana gelebilir. Örneğin, 'temizleyiciler' tek veya çift sarmallı DNA'yı kovalent olmayan etkileşimler yoluyla bağlayabilir ve sonunda PCR reaksiyon kabına ulaşan hedef sayısını azaltarak izolasyon ve saflaştırmaya müdahale edebilir.
Genel olarak PCR inhibitörleri, klinik tanı testlerinde kullanılan vücut sıvılarının ve reaktiflerin çoğunda (idrarda üre, kanda hemoglobin ve heparin), besin takviyelerinde (organik bileşenler, glikojen, yağ, Ca2+ iyonları) ve çevre bileşenlerinde (fenoller, ağır metaller) bulunur.

Daha yaygın PCR inhibitörleri bakteri ve ökaryotik hücrelerde, hedef olmayan DNA'da, doku matrislerinin DNA bağlayıcı makromoleküllerinde ve eldiven ve plastik gibi laboratuvar ekipmanlarında bulunabilir. PCR inhibitörlerini uzaklaştırmak için nükleik asitlerin ekstraksiyon sırasında veya sonrasında saflaştırılması tercih edilen yöntemdir.
Günümüzde çeşitli otomatik çıkarma ekipmanları birçok manuel protokolün yerini alabilir, ancak hedeflerin %100 geri kazanımı ve/veya saflaştırılması hiçbir zaman elde edilememiştir. Saflaştırılmış nükleik asitlerde potansiyel inhibitörler hala mevcut olabilir veya etkisini çoktan göstermiş olabilir. İnhibitörlerin etkisini azaltmak için farklı stratejiler mevcuttur. Uygun polimerazın seçimi inhibitör aktivitesi üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir. PCR inhibisyonunu azaltmak için kanıtlanmış diğer yöntemler polimeraz konsantrasyonunu artırmak veya BSA gibi katkı maddeleri uygulamaktır.
PCR reaksiyonlarının inhibisyonu, iç proses kalite kontrolünün (IPC) kullanımıyla gösterilebilir.
Ekstraksiyon kitindeki etanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, izopropanol ve fenol gibi tüm reaktiflerin ve diğer solüsyonların nükleik asit izolatından kapsamlı bir yıkama adımıyla çıkarılmasına dikkat edilmelidir. Konsantrasyonlarına bağlı olarak PCR'yi aktive edebilir veya inhibe edebilirler.