PCR reaksiyonlarında girişim faktörleri

PCR reaksiyonu sırasında sıklıkla bazı engelleyici faktörlerle karşılaşılır.
PCR'ın çok yüksek hassasiyeti nedeniyle, kontaminasyon PCR sonuçlarını etkileyen en önemli faktörlerden biri olarak kabul edilir ve yanlış pozitif sonuçlara yol açabilir.
Aynı derecede kritik olan bir diğer husus da yanlış negatif sonuçlara yol açan çeşitli kaynaklardır. PCR karışımının veya amplifikasyon reaksiyonunun temel bileşenlerinden bir veya daha fazlası engellenirse veya müdahale edilirse, tanı testi sekteye uğrayabilir. Bu durum, verimliliğin azalmasına ve hatta yanlış negatif sonuçlara yol açabilir.
İnhibisyona ek olarak, hedef nükleik asit bütünlüğünün kaybı, numune hazırlamadan önce nakliye ve/veya depolama koşullarından kaynaklanabilir. Özellikle yüksek sıcaklıklar veya yetersiz depolama, hücrelere ve nükleik asitlere zarar verebilir. Hücre ve doku fiksasyonu ve parafinle gömme, DNA parçalanmasının bilinen nedenleridir ve sürekli bir sorundur (bkz. Şekil 1 ve 2). Bu durumlarda, en uygun izolasyon ve saflaştırma bile yardımcı olmaz.

Şekil 1 | İmmobilizasyonun DNA bütünlüğü üzerindeki etkisi
Agaroz jel elektroforezi, otopsi parafin kesitlerinden izole edilen DNA'nın kalitesinin önemli ölçüde değiştiğini göstermiştir. Sabitleme yöntemine bağlı olarak, ekstraktlarda farklı ortalama parça uzunluklarına sahip DNA bulunmuştur. DNA yalnızca doğal dondurulmuş örneklerde ve tamponlanmış nötr formalinde sabitlendiğinde korunmuştur. Güçlü asidik Bouin sabitleyici veya tamponlanmamış, formik asit içeren formalinin kullanılması, DNA'da önemli bir kayba neden olmuştur. Geriye kalan kısım ise oldukça parçalanmıştır.
Soldaki grafikte, parçaların uzunluğu kilobaz çifti (kbp) cinsinden ifade edilmiştir.

Şekil 2 | Nükleik asit hedeflerinin bütünlüğünün kaybı
(a) Her iki iplikçikte de 3′-5′ yönünde bir boşluk, hedef DNA'da bir kırılmaya neden olacaktır. DNA sentezi küçük parçada yine de gerçekleşecektir. Bununla birlikte, DNA parçasında bir primer bağlanma bölgesi eksikse, yalnızca doğrusal amplifikasyon gerçekleşir. En uygun durumda, parçalar birbirini yeniden doyurabilir, ancak verimler düşük ve tespit seviyelerinin altında olacaktır.
(b) Esas olarak depürinasyon ve timidin dimer oluşumuna bağlı baz kaybı, H-bağlarının sayısında ve Tm'de azalmaya yol açar. Uzun süren ısınma aşamasında, primerler matris DNA'sından eriyerek uzaklaşacak ve daha az katı koşullar altında bile bağlanmayacaktır.
(c) Bitişik timin bazları bir TT dimer oluşturur.
Moleküler tanılamada sıklıkla karşılaşılan bir diğer sorun, fenol-kloroform ekstraksiyonuna kıyasla hedef nükleik asitlerin optimal düzeyde salınmamasıdır. Aşırı durumlarda bu, yanlış negatif sonuçlarla ilişkilendirilebilir. Hücre kalıntılarının kaynatılarak parçalanması veya enzimatik sindirimi ile zamandan tasarruf sağlanabilir, ancak bu yöntem genellikle yetersiz nükleik asit salınımı nedeniyle düşük PCR duyarlılığına yol açar.

Amplifikasyon sırasında polimeraz aktivitesinin inhibisyonu

Genel olarak, inhibisyon, yetersiz PCR sonuçlarına yol açan tüm faktörleri tanımlamak için kullanılan bir kavramdır. Tamamen biyokimyasal anlamda, inhibisyon enzimin aktivitesiyle sınırlıdır, yani DNA polimerazın aktif bölgesi veya kofaktörü (örneğin, Taq DNA polimeraz için Mg2+) ile etkileşim yoluyla substrat-ürün dönüşümünü azaltır veya engeller.
Numunedeki bileşenler veya reaktifler içeren çeşitli tamponlar ve özütler, enzimi doğrudan inhibe edebilir veya kofaktörlerini (örneğin EDTA) hapsederek polimerazı etkisiz hale getirebilir ve bu da PCR sonuçlarında azalmaya veya yanlış negatif sonuçlara yol açabilir.
Ancak, reaksiyon bileşenleri ile hedef içeren nükleik asitler arasındaki birçok etkileşim aynı zamanda 'PCR inhibitörleri' olarak da adlandırılır. Hücrenin bütünlüğü izolasyon yoluyla bozulduktan ve nükleik asit serbest bırakıldıktan sonra, örnek ile çevresindeki çözelti ve katı faz arasında etkileşimler meydana gelebilir. Örneğin, 'temizleyiciler', kovalent olmayan etkileşimler yoluyla tek veya çift sarmallı DNA'ya bağlanabilir ve PCR reaksiyon kabına ulaşan hedef sayısını azaltarak izolasyon ve saflaştırmayı engelleyebilir.
Genel olarak, PCR inhibitörleri çoğu vücut sıvısında ve klinik tanı testlerinde kullanılan reaktiflerde (idrarda üre, kanda hemoglobin ve heparin), besin takviyelerinde (organik bileşenler, glikojen, yağ, Ca2+ iyonları) ve çevredeki bileşenlerde (fenoller, ağır metaller) bulunur.

Daha yaygın PCR inhibitörleri bakteri ve ökaryotik hücrelerde, hedef olmayan DNA'da, doku matrislerinin DNA'ya bağlanan makromoleküllerinde ve eldiven ve plastik gibi laboratuvar ekipmanlarında bulunabilir. PCR inhibitörlerini gidermek için tercih edilen yöntem, ekstraksiyon sırasında veya sonrasında nükleik asitlerin saflaştırılmasıdır.
Günümüzde çeşitli otomatik ekstraksiyon ekipmanları birçok manuel protokolün yerini alabilmektedir, ancak hedeflerin %100 geri kazanımı ve/veya saflaştırılması hiçbir zaman sağlanamamıştır. Potansiyel inhibitörler saflaştırılmış nükleik asitlerde hala mevcut olabilir veya zaten etkilerini göstermiş olabilirler. İnhibitörlerin etkisini azaltmak için farklı stratejiler mevcuttur. Uygun polimeraz seçimi, inhibitör aktivitesi üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir. PCR inhibisyonunu azaltmanın diğer kanıtlanmış yöntemleri arasında polimeraz konsantrasyonunu artırmak veya BSA gibi katkı maddeleri uygulamak yer almaktadır.
PCR reaksiyonlarının inhibisyonu, dahili süreç kalite kontrolü (IPC) kullanılarak gösterilebilir.
Ekstraksiyon kitinde bulunan etanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, izopropanol ve fenol gibi tüm reaktiflerin ve diğer çözeltilerin, iyice yıkama işlemiyle nükleik asit izolatından uzaklaştırılmasına özen gösterilmelidir. Konsantrasyonlarına bağlı olarak, bu maddeler PCR'ı aktive edebilir veya inhibe edebilir.