PCR reaksiyonlarında girişim faktörleri

PCR reaksiyonu sırasında bazı engelleyici faktörlere sıklıkla rastlanmaktadır.
PCR'ın duyarlılığının çok yüksek olması nedeniyle kontaminasyon, PCR sonuçlarını etkileyen en önemli faktörlerden biri olarak kabul edilmekte ve yanlış pozitif sonuçlara yol açabilmektedir.
Yanlış negatif sonuçlara yol açan çeşitli kaynaklar da aynı derecede kritiktir. PCR karışımının veya amplifikasyon reaksiyonunun bir veya daha fazla temel bileşeninin engellenmesi veya müdahale edilmesi, tanı testini aksatabilir. Bu durum, verimliliğin azalmasına ve hatta yanlış negatif sonuçlara yol açabilir.
İnhibisyona ek olarak, numune hazırlamadan önceki nakliye ve/veya depolama koşulları nedeniyle hedef nükleik asit bütünlüğünün kaybı da meydana gelebilir. Özellikle yüksek sıcaklıklar veya yetersiz depolama, hücrelerin ve nükleik asitlerin hasar görmesine yol açabilir. Hücre ve doku fiksasyonu ve parafine gömülmesi, DNA parçalanmasının bilinen nedenleridir ve kalıcı bir sorundur (bkz. Şekil 1 ve 2). Bu durumlarda, optimum izolasyon ve saflaştırma bile işe yaramayacaktır.

Şekil 1 | Hareketsizleştirmenin DNA bütünlüğü üzerindeki etkisi
Agaroz jel elektroforezi, otopsi parafin kesitlerinden izole edilen DNA'nın kalitesinin önemli ölçüde değiştiğini göstermiştir. Ekstrelerde, fiksasyon yöntemine bağlı olarak farklı ortalama parça uzunluklarında DNA bulunmuştur. DNA, yalnızca doğal dondurulmuş örneklerde ve tamponlu nötral formalinde fiksasyon yapıldığında korunmuştur. Güçlü asidik bir Bouin fiksatifi veya tamponlanmamış, formik asit içeren formalin kullanımı, önemli miktarda DNA kaybına yol açmıştır. Kalan kısım ise oldukça parçalanmıştır.
Solda, parçaların uzunluğu kilobaz çiftleri (kbp) cinsinden ifade edilmiştir

Şekil 2 | Nükleik asit hedeflerinin bütünlüğünün kaybı
(a) Her iki iplikçikte 3′-5′'lik bir boşluk, hedef DNA'da bir kopmaya neden olur. DNA sentezi küçük parçada yine de gerçekleşir. Ancak, DNA parçasında bir primer bağlanma bölgesi eksikse, yalnızca doğrusal çoğalma gerçekleşir. En uygun durumda, parçalar birbirini yeniden doyurabilir, ancak verimler düşük ve tespit seviyelerinin altında olacaktır.
(b) Esas olarak depurinasyon ve timidin dimer oluşumundan kaynaklanan baz kaybı, H-bağlarının sayısında ve Tm'de azalmaya yol açar. Uzamış ısınma fazı sırasında, primerler matris DNA'sından eriyerek uzaklaşacak ve daha az sıkı koşullar altında bile bağlanmayacaktır.
(c) Bitişik timin bazları bir TT dimeri oluşturur.
Moleküler tanıda sıklıkla karşılaşılan bir diğer yaygın sorun, fenol-kloroform ekstraksiyonuna kıyasla hedef nükleik asitlerin optimumdan daha düşük oranda salınmasıdır. Aşırı durumlarda, bu durum yanlış negatif sonuçlarla ilişkilendirilebilir. Hücre kalıntılarının kaynatılarak lizisi veya enzimatik sindirimi ile önemli ölçüde zaman kazanılabilir, ancak bu yöntem genellikle yetersiz nükleik asit salınımı nedeniyle düşük PCR duyarlılığına yol açar.

Amplifikasyon sırasında polimeraz aktivitesinin inhibisyonu

Genel olarak inhibisyon, suboptimal PCR sonuçlarına yol açan tüm faktörleri tanımlamak için kapsayıcı bir kavram olarak kullanılır. Tamamen biyokimyasal anlamda inhibisyon, enzimin aktivitesiyle sınırlıdır; yani, DNA polimerazın aktif bölgesi veya kofaktörü (örneğin, Taq DNA polimerazı için Mg2+) ile etkileşim yoluyla substrat-ürün dönüşümünü azaltır veya engeller.
Numunedeki bileşenler veya reaktifler içeren çeşitli tamponlar ve ekstraktlar, enzimi doğrudan inhibe edebilir veya kofaktörlerini (örneğin EDTA) hapsederek polimerazı inaktive edebilir ve dolayısıyla düşük veya yanlış negatif PCR sonuçlarına yol açabilir.
Bununla birlikte, reaksiyon bileşenleri ile hedef içeren nükleik asitler arasındaki birçok etkileşim de 'PCR inhibitörleri' olarak adlandırılır. Hücrenin bütünlüğü izolasyonla bozulup nükleik asit salındığında, numune ile çevresindeki çözelti ve katı faz arasında etkileşimler meydana gelebilir. Örneğin, 'temizleyiciler' tek veya çift sarmallı DNA'ya kovalent olmayan etkileşimler yoluyla bağlanabilir ve sonunda PCR reaksiyon kabına ulaşan hedef sayısını azaltarak izolasyon ve saflaştırmayı engelleyebilir.
Genel olarak PCR inhibitörleri, klinik tanı testlerinde kullanılan çoğu vücut sıvısında ve reaktiflerde (idrarda üre, kanda hemoglobin ve heparin), besin takviyelerinde (organik bileşenler, glikojen, yağ, Ca2+ iyonları) ve çevre bileşenlerinde (fenoller, ağır metaller) bulunur.

Daha yaygın PCR inhibitörleri, bakteri ve ökaryotik hücrelerde, hedef olmayan DNA'da, doku matrislerinin DNA bağlayıcı makromoleküllerinde ve eldiven ve plastik gibi laboratuvar ekipmanlarında bulunabilir. PCR inhibitörlerini uzaklaştırmak için, ekstraksiyon sırasında veya sonrasında nükleik asitlerin saflaştırılması tercih edilen yöntemdir.
Günümüzde çeşitli otomatik ekstraksiyon ekipmanları birçok manuel protokolün yerini alabilir, ancak hedeflerin %100 geri kazanımı ve/veya saflaştırılması hiçbir zaman sağlanamamıştır. Saflaştırılmış nükleik asitlerde potansiyel inhibitörler hala mevcut olabilir veya etkisini göstermiş olabilir. İnhibitörlerin etkisini azaltmak için farklı stratejiler mevcuttur. Uygun polimerazın seçimi, inhibitör aktivitesi üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir. PCR inhibisyonunu azaltmak için kanıtlanmış diğer yöntemler arasında polimeraz konsantrasyonunu artırmak veya BSA gibi katkı maddeleri uygulamak yer alır.
PCR reaksiyonlarının inhibisyonu, iç proses kalite kontrol (IPC) kullanımıyla gösterilebilir.
Ekstraksiyon kitindeki etanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, izopropanol ve fenol gibi tüm reaktiflerin ve diğer solüsyonların, nükleik asit izolatından iyice yıkanarak uzaklaştırılmasına dikkat edilmelidir. Konsantrasyonlarına bağlı olarak, PCR'ı aktive edebilir veya inhibe edebilirler.