PCR reaksiyonlarında girişim faktörleri

PCR reaksiyonu sırasında, genellikle bazı engelleyici faktörlerle karşılaşılır.
PCR'nin çok yüksek duyarlılığı nedeniyle kontaminasyon, PCR sonuçlarını etkileyen en önemli faktörlerden biri olarak kabul edilir ve yanlış pozitif sonuçlara neden olabilir.
Yanlış negatif sonuçlara yol açan çeşitli kaynaklar da eşit derecede kritiktir.PCR karışımının bir veya daha fazla temel parçası veya amplifikasyon reaksiyonunun kendisi inhibe edilir veya bunlara müdahale edilirse, teşhis testi engellenebilir.Bu, verimliliğin düşmesine ve hatta yanlış negatif sonuçlara yol açabilir.
İnhibisyona ek olarak, numune hazırlamadan önceki nakliye ve/veya saklama koşulları nedeniyle hedef nükleik asit bütünlüğünün kaybı meydana gelebilir.Özellikle yüksek sıcaklıklar veya yetersiz depolama, hücrelerin ve nükleik asitlerin zarar görmesine neden olabilir.Hücre ve doku fiksasyonu ve parafine gömülmesi, DNA parçalanmasının iyi bilinen nedenleridir ve kalıcı bir sorundur (bakınız Şekil 1 ve 2).Bu durumlarda, optimal izolasyon ve saflaştırma bile yardımcı olmayacaktır.

Şekil 1 |İmmobilizasyonun DNA bütünlüğü üzerindeki etkisi
Agaroz jel elektroforezi, otopsilerin parafin kesitlerinden izole edilen DNA'nın kalitesinin önemli ölçüde değiştiğini göstermiştir.Sabitleme yöntemine bağlı olarak ekstraktlarda farklı ortalama fragman uzunluklarına sahip DNA mevcuttu.DNA, yalnızca doğal donmuş numunelerde ve tamponlu nötr formalinde sabitlendiğinde korunmuştur.Güçlü bir asidik Bouin fiksatifi veya tamponlanmamış, formik asit içeren formalin kullanımı, önemli bir DNA kaybına neden oldu.Kalan fraksiyon oldukça parçalanmıştır.
Solda, parçaların uzunluğu kilobaz çiftleri (kbp) cinsinden ifade edilir.

Şekil 2 |Nükleik asit hedeflerinin bütünlüğünün kaybı
(a) Her iki şeritte 3'-5' boşluk, hedef DNA'da bir kırılmaya neden olacaktır.DNA sentezi yine de küçük parça üzerinde gerçekleşecektir.Bununla birlikte, DNA fragmanında bir primer tavlama bölgesi eksikse, yalnızca lineer amplifikasyon meydana gelir.En uygun durumda, parçalar birbirini yeniden doyurabilir, ancak verimler küçük ve tespit seviyelerinin altında olacaktır.
(b) Esas olarak depürinasyon ve timidin dimer oluşumuna bağlı olarak bazların kaybı, H-bağlarının sayısında bir azalmaya ve Tm'de bir azalmaya yol açar.Uzatılmış ısıtma fazı sırasında, primerler matris DNA'sından eriyecek ve daha az sıkı koşullar altında bile tavlanmayacaktır.
(c) Bitişik timin bazları bir TT dimer oluşturur.
Moleküler tanılamada sıklıkla ortaya çıkan diğer bir yaygın sorun, fenol-kloroform ekstraksiyonuna kıyasla hedef nükleik asitlerin optimumdan daha az salınmasıdır.Aşırı durumlarda, bu yanlış negatiflerle ilişkilendirilebilir.Kaynar lizis veya hücre artıklarının enzimatik sindirimi ile çok zaman kazanılabilir, ancak bu yöntem yetersiz nükleik asit salınımı nedeniyle genellikle düşük PCR duyarlılığıyla sonuçlanır.

Amplifikasyon sırasında polimeraz aktivitesinin inhibisyonu

Genel olarak inhibisyon, yetersiz PCR sonuçlarına yol açan tüm faktörleri tanımlamak için kapsayıcı bir kavram olarak kullanılır.Kesin biyokimyasal anlamda inhibisyon, enzimin aktivitesi ile sınırlıdır, yani DNA polimerazın aktif bölgesi veya kofaktörü (örn. Taq DNA polimeraz için Mg2+) ile etkileşim yoluyla substrat-ürün dönüşümünü azaltır veya önler.
Numunedeki bileşenler veya reaktifler içeren çeşitli tamponlar ve ekstraktlar, enzimi doğrudan inhibe edebilir veya kofaktörlerini (örn. EDTA) yakalayabilir, böylece polimerazı etkisiz hale getirebilir ve sonuç olarak azalmış veya yanlış negatif PCR sonuçlarına yol açabilir.
Bununla birlikte, reaksiyon bileşenleri ve hedef içeren nükleik asitler arasındaki birçok etkileşim de 'PCR inhibitörleri' olarak adlandırılır.Hücrenin bütünlüğü izolasyonla bozulduğunda ve nükleik asit salındığında, numune ile onu çevreleyen çözelti ve katı faz arasında etkileşimler meydana gelebilir.Örneğin, 'çöpçüler', kovalent olmayan etkileşimler yoluyla tek veya çift sarmallı DNA'yı bağlayabilir ve sonunda PCR reaksiyon kabına ulaşan hedeflerin sayısını azaltarak izolasyon ve saflaştırmaya müdahale edebilir.
Genel olarak, PCR inhibitörleri çoğu vücut sıvısında ve klinik teşhis testleri için kullanılan reaktiflerde (idrarda üre, kanda hemoglobin ve heparin), diyet takviyelerinde (organik bileşenler, glikojen, yağ, Ca2+ iyonları) ve çevredeki bileşenlerde (fenoller) bulunur. , ağır metaller)

Daha yaygın PCR inhibitörleri, bakteri ve ökaryotik hücrelerde, hedef olmayan DNA'da, doku matrislerinin DNA'ya bağlanan makromoleküllerinde ve eldivenler ve plastikler gibi laboratuvar ekipmanlarında bulunabilir.Ekstraksiyon sırasında veya sonrasında nükleik asitlerin saflaştırılması, PCR inhibitörlerini uzaklaştırmak için tercih edilen yöntemdir.
Bugün, çeşitli otomatik ekstraksiyon ekipmanı, birçok manuel protokolün yerini alabilir, ancak hedeflerin %100 geri kazanılması ve/veya saflaştırılması hiçbir zaman sağlanamamıştır.Saflaştırılmış nükleik asitlerde potansiyel inhibitörler hala mevcut olabilir veya etkisini çoktan göstermiş olabilir.İnhibitörlerin etkisini azaltmak için farklı stratejiler mevcuttur.Uygun polimerazın seçimi, inhibitör aktivitesi üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir.PCR inhibisyonunu azaltmak için kanıtlanmış diğer yöntemler, polimeraz konsantrasyonunu arttırmak veya BSA gibi katkı maddeleri uygulamaktır.
PCR reaksiyonlarının inhibisyonu, dahili proses kalite kontrolü (IPC) kullanılarak gösterilebilir.
Etanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, izopropanol ve fenol gibi ekstraksiyon kitindeki tüm reaktiflerin ve diğer solüsyonların kapsamlı bir yıkama adımıyla nükleik asit izolatından çıkarılmasına özen gösterilmelidir.Konsantrasyonlarına bağlı olarak PCR'yi aktive edebilir veya inhibe edebilirler.